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　　文章轉(zhuǎn)載自“安捷倫診斷與基因組學”公眾號

　　全外顯子組測序的應用場景越來越多，根據(jù)不同應用場景打造更適配的檢測產(chǎn)品，使之成為一種高效、便捷的測序方案。

　　從 2009 年至今，基于 SureSelect 液相雜交捕獲技術(shù)，安捷倫持續(xù)推出更優(yōu)秀的 WES 檢測產(chǎn)品。SureSelect WES V8 即最新上市的產(chǎn)品體系，機器學習驅(qū)動的探針鋪設方式帶來了更優(yōu)異的數(shù)據(jù)表現(xiàn)和極高的設計占比。

　　區(qū)別于既往 V6/V7，V8 在核心版本之外，還包含 NCV/UTR/CNV Backbone/Mito 等版本，為什么需要這些不同的產(chǎn)品組合以及它們各自適應于什么樣的應用場景，則是本文的重點。

　　我們將從基因組結(jié)構(gòu)與功能(上篇)、應用案例（下篇）兩個維度進行闡述。

　　圖 1：安捷倫最新 SureSelect WES V8 產(chǎn)品家族

　　WES+NCV

　　NCV: Non-coding Clinical Variants

　　存在即合理，BUT，存在即有用嗎？

　　事實上，每個基因中都有編碼區(qū)與非編碼區(qū)，非編碼區(qū)在對基因的表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用，如啟動子，增強子，終止子等都位于該區(qū)域。所以，非編碼序列并非“垃圾 DNA”。

　　人類基因組中 98.5% 是非編碼序列，非編碼區(qū)雖然不編碼蛋白質(zhì)，但對于遺傳信息表達是不可缺少的。

　　對遺傳病而言，近 90% 的易感變異位于基因組非編碼區(qū)，其下游調(diào)控機制未知，亟需解析其分子調(diào)控機制，才能將基因組學的發(fā)現(xiàn)最終轉(zhuǎn)化為臨床藥物靶標。

　　人類基因組非編碼區(qū)的注釋和變異致病性的預測，及變異機制的解析，是當前遺傳學領(lǐng)域的研究熱點和難點。

　　2022 年 7 月，Genome Medicine 雜志發(fā)表了一篇《對基因組非編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)的變異的臨床注釋建議》的文章，為改善罕見病的診斷，以及評估其他非編碼變體的致病性提供了更明確的指導。

　　在腫瘤的研究當中，non-coding somatic mutations 也非常重要，例如肝癌等多種腫瘤中的 TERT 啟動子、T 細胞急性淋巴細胞白血病中 TAL1 基因的增強子，結(jié)直腸腫瘤中 CTCF/cohesin-binding sites 等等。

　　非編碼基因組具有高突變率和重復性的特點，這就導致了較高的背景突變以及潛在的 mapping errors；因而，對于功能性非編碼區(qū)域的識別與特征分析，相比于編碼區(qū)的驅(qū)動突變，有著獨特的挑戰(zhàn)。

圖 2：基因結(jié)構(gòu)示意圖

　　相比于其他同類產(chǎn)品，安捷倫 SureSelect WES V8+NCV 產(chǎn)品，更好的覆蓋了 HGMD，ACMG，ClinVar 數(shù)據(jù)庫中的致病和可能致病的遺傳變異，為遺傳學家提供了更有力的研究復雜遺傳疾病的利器。

　　安捷倫 SureSelect WES V8+NCV 的覆蓋情況

　　WES+UTR

　　先來看看什么是 UTR？

　　UTR: 即 untranslated region，非翻譯區(qū)，是 mRNA 分子兩端的非編碼片段。

　　當從 DNA 轉(zhuǎn)錄為成熟 mRNA 后，會從第一個 AUG (起始密碼子)開始翻譯產(chǎn)生蛋白，這即是我們熟悉的中心法則。

　　但是請注意，翻譯起始位點并不是從第一個外顯子最前端開始的，而是 5’ 端第一個 AUG，那么，在起始密碼子之前的序列就是 5’UTR exon (untranslated region)（即圖 2 中第三個條的深藍色部分）；相應的，在 3’ 端的終止密碼子之后，也有一部分不翻譯的外顯子被稱為 3’UTR exon （即圖 2 中第三個條的后端綠色區(qū)域）。

　　簡單一個小題目，快速記憶：哪個區(qū)域參與基因組翻譯過程?

　　A：3’UTR exons

　　B：5’UTR exons

　　C：CDS exons

　　點擊下方空白處查看答案

　　正確答案：C

　　5’UTR 與 3’UTR，其長度是多少呢？

　　真核生物 5′ 非翻譯區(qū)的中位數(shù)長度一般約為 150 核苷酸（nt），但有些可長達數(shù)千堿基。有些病毒和細胞的基因有著非常長和結(jié)構(gòu)性的 5' 非翻譯區(qū)，這可能會影響基因表達。平均而言，3′ 非翻譯區(qū)往往是 5′ 非翻譯區(qū)的兩倍長。

　　舉一個例子：

　　CDK4 基因，在乳腺癌中是非常重要的藥物靶點。它的第一個外顯子加上第二個外顯子的前半部分，都是 5'UTR Exon，從 exon2 中間位置的 ATG 才開始翻譯（圖 3 中紅色方框）。

圖 3：CDK4 基因的部分結(jié)構(gòu)示意圖

　　UTR 區(qū)域有許多調(diào)控元件， 例如，uORFs（upstream ORFs）、IRESs（Internal ribosome entry sites，內(nèi)部核糖體進入位點）、poly(A) 信號、miRNA 結(jié)合位點等。

　　5’UTR 主要功能包括：調(diào)控 mRNA 出細胞核，核糖體招募，調(diào)節(jié)翻譯起始、調(diào)節(jié) mRNA 穩(wěn)定性等等；

　　3'UTR 主要功能包括：調(diào)節(jié) mRNA 的穩(wěn)定性，調(diào)控 mRNA 的定位表達，調(diào)控 mRNA 的翻譯，通過結(jié)合多個 RNA 綁定蛋白來行使調(diào)控功能等等。

　　圖 4. 5’ and 3’UTR elements and how they are co-opted in cancer.

　　引自：Trends Cancer. 2019 April ; 5(4): 245–262. doi:10.1016/j.trecan.2019.02.011.

　　關(guān)于這些調(diào)控元件的生物學作用，例如在學習與記憶、神經(jīng)退行性疾病、惡性腫瘤等疾病中的作用，依然有很多待回答的科學問題。

　　對于真核 UTR 的結(jié)構(gòu)和功能開展廣泛和深入的研究，去闡明各類基因翻譯背后的精密調(diào)控機制，為針對更精細翻譯水平的新診療策略研究鋪平道路，是當前研究的重要問題。

　　安捷倫 SureSelect WES V8+UTR 的覆蓋情況和測序表現(xiàn)

　　WES+CNV backbone

　　CNV（Copy number variation，拷貝數(shù)變異）是人類遺傳病的一大重要原因，由基因組發(fā)生重排而導致。

與 CNV 變異相關(guān)的疾病示例

　　隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，被鑒定發(fā)現(xiàn)的 CNV 數(shù)量越來越多，已有超過數(shù)萬個 CNV 位點被記錄在 DGV 數(shù)據(jù)庫(Database of Genomic Variants)中，這些 CNV（主要為微缺失和微重復）所覆蓋的染色體范圍約占人類全基因組的 20% 以上。

　　CNV 在全基因組范圍內(nèi)都可能發(fā)生，如果僅針對外顯子區(qū)檢測會導致大量的疾病相關(guān) CNV 的漏檢。為了更全面的檢出 CNV，需專門添加可提高 CNV 檢出準確度的高密度 SNP 骨架。這樣一方面有利于提高檢測分辨率，另一方面可以覆蓋沒有基因編碼區(qū)的致病性區(qū)域。

　　安捷倫 OneSeq 可在一次經(jīng)濟有效的 NGS 分析中檢索所有的變異類型，快速發(fā)現(xiàn)疾病有關(guān)的新型變異，揭示疾病相關(guān)的生物學通路。安捷倫提供了兩套不同檢測分辨率的 SureSelect OneSeq CNV Backbones，分別可以實現(xiàn) 1 Mb CNV 檢測分辨率 和 300 kb CNV 檢測分辨率。

　　OneSeq CNV 骨架捕獲探針設計用于靶向具有最佳 GC 含量和可定位的基因組區(qū)域。這樣即可產(chǎn)生高度一致的測序深度分布，并最終獲得可靠的全基因組 CNV 檢測。

　　而且，OneSeq CNV 骨架捕獲探針可與任意 SureSelect 目錄外顯子組聯(lián)合使用，以進行 SNV、插入和缺失檢測。即使在 CNV 骨架捕獲探針存在的情況下，這些區(qū)域仍然具有極佳的覆蓋率，從而可確保檢測的準確性。

　　WES+Mito

　　線粒體是普遍存在于生物體細胞內(nèi)提供能量的細胞器，而且線粒體中含有遺傳信息，是一個獨立的遺傳體系。

線粒體 DNA 示意圖

　　人類線粒體基因組（Mitochondria DNA，mtDNA）的全長 16.6kb, 是一種雙鏈環(huán)狀 DNA，不具有內(nèi)含子 — 外顯子結(jié)構(gòu)，僅含有 37 個基因。線粒體基因組具有獨特的特征，包括結(jié)構(gòu)簡單、編碼區(qū)域高度保守、母系遺傳、重組率低、拷貝數(shù)高、異質(zhì)性等。

部分線粒體疾病示例

　　每一個細胞中含有數(shù)百至數(shù)千個 mtNDA 拷貝。通常 mtDNA 具有異質(zhì)性，即同時存在突變以及野生型的 mtDNA，并且每個細胞、組織中的 mtDNA 的突變比例及拷貝數(shù)并不一致。

　　線粒體 DNA（mtDNA）突變，會導致多種線粒體遺傳病和線粒體功能異常，如帕金森綜合征、阿爾茲海默癥、糖尿病、腫瘤等。捕獲完整的線粒體基因組有利于對線粒體基因病的檢測與研究。

　　以 SureSelect WES V8 為核心，安捷倫提供了以上優(yōu)異的產(chǎn)品組合，并可實現(xiàn)個性化定制，滿足不同應用場景的基因組學研究項目。SureSelect WES 產(chǎn)品深度解析（下篇）將聚焦應用案例，展示 SureSelect 產(chǎn)品的廣泛應用。

　　以上內(nèi)容僅限研究使用。不可用于診斷目的。